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寡核苷酸帽法(Oligo
caping method)
日本东京大学铃木等新近开发了一种确定转录起始位点的新方法，命名为寡核苷酸帽法(Oligo
capping method)。其特点为大规模、高通量、高精确度，具有借鉴意义，本文予以介绍。
1. 传统的cDNA克隆化技术的缺点
理想的克隆cDNA应包含模板mRNA的5'帽的结构以及3'多聚A尾的全长序列。 然而，传统的方法克隆的cDNA，多数情况下其5'末端为部分缺失状态。究其原因有二：一是在以mRNA模板进行逆转录过程中，逆转录酶在从模板mRNA中逆转录酶脱落，只能得到部分拷贝的cDNA产物；二是在进行逆转录过程中，用了部分5'末端被降解的mRNA为模板合成cDNA，因此在构建cDNA文库中得到的多数是5'末端部分缺失状态的cDNA。换言之，在构建cDNA文库的过程中，应用逆转录酶以及应用极易受降解的mRNA是不可避免的，因此5'末端部分缺失就不足为奇了。
2.全長cDNA的克隆
为了构建含全長的cDNA 文库，就有必要从含有多数为非全长的cDNA文库中挑选出全長cDNA的一个过程。如果我们有办法识别全長cDNA的5'端和3'端，就有可能挑选出全长cDNA。
mRNA的3'端中有一个多聚 A尾结构可作为明确的识别标记。事实上、传统的cDNA文库的构建过程，也正是利用了
mRNA 3'端这一特征性的标签（tag），用多聚T引物合成cDNA的第一链而构建的。在mRNA的5'端存在一个帽结构，而自然状态下的这一结构不能象3'端的多聚
A尾一样，直接作为一个识别标记。由此可以设想，把这一结构用某种序列来替换，使其变成一个象多聚
A尾一样的特征性的序列标签（sequence tag），就有可能作为一个识别标记，这就是寡核苷酸帽法作为
5'端的识别标记的思路。
3.
全長cDNA文库的构建
为了克服传统的方法构建cDNA文库中所存在的缺点，铃木等开发了用特征性的序列标签替换mRNA5'端的帽的新方法—寡核苷酸帽法(Oligo
caping method)。这一方法所获得的mRNA 5'端有RNA寡核苷，3'端有多聚
A尾特征性，因此其两端均有特征性的序列标签作为识别标记，我们就可能构建只含有全长cDNA的文库。下图表示了寡核苷酸帽法的具体过程。
4．本技术的意义
确定启动子区域精确的确定基因的转录起始位点。
基因的启动子区域中含有许多重要的调控基因转录的DNA序列（顺式元件），若要阐明基因在转录水平上的调控机制，克隆启动子序列是必不可缺的关键一环。到目前为止，已阐明启动子序列以及它们的调控机制的基因数量非常有限。事实上，标准的真核生物有关的启动子数据库Eukaryotic
Promoter Database中登录的基因启动子也不过数百个而已。这其中一个重要原因之一是许多基因未能确切的确定转录起始位点。S1核酸酶作图法、引物延伸法、5'RACE法等传统的转录位点的确定方法，技術要求比较高，且有时由于种种原因，难以确定确切的转录起始位点。而利用铃木等开发的寡核苷酸帽法构建的cDNA文库中，随机的克隆全長的cDNA，适合于大规模、精确的获得基因转录起始位点的信息。
注：有关详细的操作过程另文介绍。
参考文献
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and Sumio Sugano (2002)
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Sites and full-length cDNAs. Nucleic Acids Res.
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Maruyama K. and Sugano, S.
(1994)
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Suzuki Y, Yoshitomo-Nakagawa
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Construction and characterization of a full
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Suzuki Y, Taira H, Tsunoda
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Isogai T, Tanaka T, Morishita S, Okubo K, Sakaki
Y, Nakamura Y, Suyama A, Sugano S. (2001)
Diverse transcriptional initiation revealed
by fine, large-scale mapping of mRNA start sites.
EMBO Rep. 2: 388-393.
http://elmo.ims.u-tokyo.ac.jp/dbtss/
（徐明旭供稿）
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