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1．课题组名称：
国家人类基因组北方中心功能基因组Ⅲ
2．课题组负责人和联系方式：
石太平:
电话：67883332-868
E-mail：taiping_shi@yahoo.com.cn；tpshi@126.com
3． 主要研究方向和研究内容：
人类重要生理活性及具有药物开发前景的功能基因研究
主要研究内容包括：主要研究内容包括：开展高通量的人类功能新基因（包括未进行功能注释的已知基因）克隆表达和规模化人类重组蛋白表达工作，并建立含有全套生物信息学信息的遴选基因二级数据库，特别是可以作为药物靶标和基因工程药物的人类功能基因数据库；建立高通量、高内涵的人类功能基因筛选体系；对初筛获得的有功能线索基因进行系统性体内外功能研究；最终获得一部分能进入基因组药物开发性研究的人类功能基因。
4.主要关键技术及目前的成果 ：
（1）人类重要功能基因遴选和数据分析
充分利用生物信息学技术和已知数据库，加强对人类基因组序列的注释，重点发掘未知功能，并有序列特色的人类基因编码序列（如小分子分泌蛋白，有重要功能区、新转录因子、新的酶类等），提供全套的生物信息学分析资料。建立了大规模测序后序列的全长分析与剪接体预测的平台。已经形成高通量的二次PCR方法及大规模的构建全长克隆真核表达文库。目前，整个全长cDNA真核表达库包含人类功能基因2924个。并对正确克隆的序列做了初步注释，包括细胞定位、信号肽、跨膜区、剪切体预测及表达谱、结构域分析等，为功能实验提供一定线索。还建立了数据库对所获基因的实验数据，注释及其它生物信息实现规范化管理。
（2）高通量人类重组蛋白质表达
利用哺乳动物表达系统、原核表达系统、腺病毒及腺相关病毒表达系统、杆状病毒表达系统等对上阶段获得的基因进行高通量表达。首选的表达系统是哺乳动物表达系统，初步发现功能后，再开展多系统表达、纯化工作，获得重组蛋白质纯品，并制备抗体。
2005年开始，本中心与美国Vector BioLab公司合作，建立高通量腺病毒构建平台，已完善了从重组腺病毒表达载体的克隆、包装、扩增到纯化的成熟的系统技术工艺。迄今共获得500余个腺病毒构建质粒并完成了包装。本系统是以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒DNA为骨架的复制缺陷型重组腺病毒系统，通过对比其它系统（包括Adeasy、Adeno-X、AdMax等系统），对穿梭载体，病毒骨架载体和包装细胞系都做了改进，并且在克隆、包装、扩增、纯化、滴度测定等各步也做了改进和优化，经过大量的实验和重复验证工作后，达到了克隆阳性率更高、质量更可靠、包装稳定、出毒迅速、滴度高等效果。使得本系统比上述其他系统有了更强大的优势，可提供高品质、高产量的重组腺病毒。在此基础上，还拓展了更广泛的应用，可以提供各种带报告基因（如GFP、RFP、Luciferase、LacZ等），带不同标签（如HA、myc、His、Flag等）的腺病毒构建和包装服务及RNAi重组腺病毒的构建和包装服务。所包装的腺病毒已成功应用于信号转导，基因转位，Co-IP，动物实验，干细胞研究，原代细胞研究，神经细胞研究等科研实验。可以完成较高难度的克隆构建，包括具有细胞毒性作用基因的腺病毒构建，在短时间内完成从原始质粒到病毒DNA的构建工作。
（3）高通量、高内涵的人类功能基因筛选体系的建立
本本阶段旨在建立多系统的实验功能筛选技术，包括细胞水平的体外筛选技术、酵母双杂交技术、基因编码蛋白的细胞定位和迁移分析技术、以双相电泳和质谱分析为主要手段的蛋白质组学技术、反义封闭技术、生物芯片筛选技术等。少数重要功能基因可进行转基因小鼠和基因敲除小鼠的研究。本阶段特别鼓励功能基因筛选的新思路、新技术，并且必须多学科优势单位集成完成。
目前，就细胞水平的体外筛选技术建立的报告基因筛选体系包括：
基于荧光素酶的顺式报告基因体系：NFκB、NFAT、AP1、GAS、ISRE、CRE、P53、TARE、STAT3、SRE、SRF、HRE；
基于荧光素酶的反式报告基因体系：cJUN、CREB、ELK1、CHOP；
基于GFP荧光报告基因体系：AP1、NFκB、NFAT、CRE；
研究转位的筛选体系：PKCα、PKCβ、PKCθ、RelA、c-Jun、NFAT1、NFAT4、VIVIT、LC3、CCR4、IκB；
基于荧光染料用于研究细胞增殖、分化、凋亡、粘附及细胞内钙流的高通量筛选体系；
此外，还建立了研究细胞形态及细胞属性、凋亡和转位的细胞芯片技术，以及基于细胞芯片的报告基因筛选体系，并整合多种指标形成高通量、高内涵的人类功能基因筛选体系。同时也建立了WESTERN、EMSA、RT-PCR、RNAi筛选系统、酵母双杂交筛选体系及CoIP等二次筛选及验证技术。其中，部分筛选平台已经开展了1000个基因的筛选工作，累计获得了70多个阳性结果。
（4）人类重要功能基因的系统性研究
在筛选获得一批具有明确功能线索人类基因的基础上，根据其主要功能，以单个基因为单项分课题，分别在优势单位开展系统性研究，包括体内外功能、生理病理效应、信号转导通道、作为药物靶标或重组蛋白药物的潜在可能性等。其中，首次对新调亡诱导基因NAIF1和PTPIP51、新自噬相关TMEM166等的系统性功能研究已形成专利和SCI文章。
（5）基因组药物的开发性研究
在上述工作的基础上，少量的人类功能基因（约1/10）可能进入基因组药物（genome-based drug）研发阶段。
1.发表文章
1.Cell-based screening and validation of human novel genes associated with cell viability. J Biomol Screen, 2006, Jun; 11(4): 369-376.
2.Overexpression of the novel human gene, nuclear apoptosis-inducing factor 1, induces apoptosis. Int J Biochem Cell Bio, 2006, 38: 671-683.
3.细胞筛选平台在人类功能基因组研究中的应用。生物化学与生物物理进展， 2005, 32(11): 1003-1010.
4.Protein tyrosine phosphatase interacting protein 51 (PTPIP51) is a novel mitochondria protein with an N-terminal mitochondrial targeting sequence and induces apoptosis. Apoptosis, 2006, Sep; 11(9): 1489-1501.
5.Cloning of a novel human Caspase-9 splice variant containing only the CARD domain. Life Sciences, 2006, Aug 1; 79(10): 934-940.
6.Cloning, expression and subcellular localization of a novel human gene-RNF122. Beijing Da Xue Xue Bao. 2006, Jun 18; 38(3): 239-243. Chinese.
7.Identification of five human novel genes associated with cell proliferation by cell-based screening from an expressed cDNA ORF library. Life Sciences, 2007, Sep 15; 81(14):1141-1151.
8.ACDF1, autophagic cell death factor 1, regulates cell autophagy and apoptosis. Apoptosis, 2007, May 11.
9.Screening for novel human genes associated with CRE pathway activation with cell microarray. Genomics, 2007, May 7.
10.利用线粒体膜电位测定筛选参与细胞凋亡的人类新基因。生物化学与生物物理进展，2007，34(6)：1-6。
11.TMEM74, a lysosome and autophagosome protein, regulates autophagy. J Cell Physiology, 2007, Revised.
2.申请专利：
1.专利申请号：200410009098.3，一种抑制人体细胞核因子NF-κB和NFAT活化的基因及其编码的多肽和用途 已获授权
2.专利申请号：200510011149.0，抑制人体转录因子AP-1的基因及其编码多肽和用途
3.专利申请号：200510085500.0，诱导细胞凋亡的多核苷酸及其编码多肽和用途
4.专利申请号：200510112975.4，细胞增殖相关的多核苷酸及其编码多肽和用途
5.专利申请号：200510112974.X，促进人体转录因子NF-κB活化的多核苷酸及其编码多肽和用途
6.专利申请号：200510102772.7，影响SRE活性的多核苷酸及其编码多肽和用途
7. 专利申请号：200510112972.0，BPY2IP1基因在抑制CRE活化上的应用
8.专利申请号：200510112970.1，影响ELK1活性的多核苷酸及其编码多肽和用途
9.专利申请号：200510112973.5，激活CRE活性的多核苷酸及其编码多肽和用途
10.专利申请号：200510103026.X，一种肿瘤相关蛋白及其编码基因与应用 已获授权
11.专利申请号：200610160760.4，人类新细胞因子及其用途
12.专利申请号：200610165851.7，线粒体膜电位下降相关的多核苷酸及其编码多肽和用途
13.专利申请号：200510134520.2，一种骨质疏松相关基因及其编码蛋白和用途
14.专利申请号：200510134521.7，抑制Wnt活性的多核苷酸及其编码多肽和用途
5、科研合作方式和意向：
目前，本课题组建立的人类基因高通量克隆、鉴定、表达的技术平台以及人类功能基因活性筛选平台能够实现对外服务，并形成一定的市场规模及效益。同时，课题组已经开展了对国内科研单位提供重组腺病毒表达载体的克隆、包装、扩增到纯化的服务。
本课题具有源头创新的特点，将获得一批新的具有潜在药物开发前景的人类功能基因，申请一批人类功能基因的专利，本课题的成功实施，将改变我国新药开发几乎完全仿制的局面，为我国具有自主知识产权的新药打入国际市场提供基础，具有巨大的经济开发潜力。本课题通过筛选鉴定具有明确功能的人类基因及其产物，还能够发挥技术辐射作用，不仅直接为生物技术药物开发提供产品，而且在不同阶段可以开发不同的基因和蛋白质产品，包括可以转让的基因蛋白专利、针对人类蛋白质的新抗体、生物芯片的靶基因和靶蛋白、分子生物学试剂、基因治疗靶基因、疫苗佐剂等，与产业化衔接紧密，具有良好的市场前景，经济效益明显。
同时由于本课题工作量大、技术复杂、投资高，需要加强与各科研单位、新药研制开发单位和专家联合开展工作，充分发挥社会的资金与人才的力量。科研单位于企业可以介入三个不同阶段的运作，提供技术或资金，参与高通量功能筛选、系统性功能研究、基因开发研究。参与单位可以以成果利益共享或技术转让等不同方式合作，具体事宜和细节另行商定。
北京大学人类疾病基因研究中心
2007．10．15
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