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一、发现和命名
本中心与国家人类基因组北方研究中心合作，建立了多种人类新基因功能筛选平台，经过高通量筛选[1]，发现人类未知功能基因TMEM166（又名FLJ13391）具有诱导细胞死亡的作用，我们沿用了GenBank的TMEM166命名。
二、结构和表达谱
TMEM166基因定位于2p12，由4个外显子和3个内含子组成，剪接符合GT-AG规律。cDNA序列全长1,639
bp，编码152个氨基酸，分子量17.5 kDa，等电点6.5。TMHMM分析揭示该蛋白质的N端有一个潜在的跨膜区（第34-56位氨基酸残基）。Signal
P分析无明显的信号肽。TMEM166在人类、猩猩、大鼠、小鼠、家犬等物种中存在同源物，是一个比较保守的分子。
Gene Atlas 数据库检索提示TMEM166表达谱比较广泛。Northern blot实验证明了TMEM166
mRNA的存在，其大小约1.7 kb，与生物信息分析的结果（1,639 bp）相吻合。另外，RT-PCR结果显示TMEM166在人正常组织（肾、肝、肺、胰腺、胎盘）、人肿瘤组织（胆囊、结肠、食管、肝、肺、肾、直肠、胃）以及人细胞系（HeLa、MDA、293、A549、PC3、U937、293T）中都有表达，说明TMEM166具有广谱表达的特点。
三、功能
TMEM166真核表达质粒转染293T与HeLa细胞后具有诱导细胞死亡的作用，此外TMEM166明显抑制HeLa细胞的克隆形成能力。进一步研究显示，TMEM166在细胞死亡的早期阶段（转染后20小时）能够诱导HeLa细胞呈现典型的自噬特征，包括电镜下广泛的自噬性空泡的出现、MDC染色和GFP-LC3点状化分布以及LC3-II型蛋白比例的增加等。另一方面，随着转染时间的延长（转染后40小时），TMEM166诱导细胞出现了凋亡的特征，如染色体固缩、PS外翻、线粒体膜电位降低、Caspase活化、PARP切割等。动力学实验也揭示TMEM166诱导的自噬指标的出现早于凋亡的改变。通过电镜我们发现TMEM166最终同时诱导细胞出现了I型程序性细胞死亡（凋亡）和II型程序性细胞死亡（自噬性细胞死亡）。
通过构建pEGFP-N1-TMEM166质粒表达GFP融合蛋白显示，TMEM166在细胞内呈胞质点状分布。使用细胞器特异性染料通过共聚焦显微镜显示TMEM166与溶酶体和内质网特异性的染料发生了共定位，说明TMEM166可能是一个定位于溶酶体和内质网的膜蛋白。
生物信息分析提示TMEM166分子N端有一个TM结构域，我们通过PCR方法将该结构域去除，构建了缺失突变体分子TMEM166-△TM，同时融合GFP标签进行定位研究。结果显示，TMEM166-△TM不再呈现特定的亚细胞定位，而是在胞质内弥散分布。同时TMEM166-△TM不能诱导HeLa细胞发生自噬与凋亡。结果表明，该TM结构域对于TMEM166的定位及其功能的发挥具有重要的作用。
此外我们设计并化学合成3条针对TMEM166基因的siRNA，经过Real-time PCR验证获得了一条抑制效果很好的si-TMEM166。进一步研究提示封闭内源性TMEM166能够抑制饥饿所诱导的自噬作用。
综上所述，TMEM166是一个新的溶酶体和内质网相关蛋白，并且参与到自噬与凋亡的过程中。对于其分子机制的进一步研究有助于阐明这两种程序性细胞死亡的关系[2]。
四、合作意想
目前，本中心正在进一步开展TMEM166的功能和分子作用机理的研究。本中心已经制备了抗TMEM166多克隆抗体，构建了TMEM166真核表达质粒、GFP细胞定位表达质粒、腺病毒表达克隆等，希望与基础与临床研究的实验室合作开展TMEM166的功能和应用研究。
联系人：陈英玉副教授，Tel：82802846-420；Email：yingyu_chen@bjmu.edu.cn
石太平，Tel：67883332-868；Email：taiping_shi@yahoo.com.cn
参考文献
1． Lan Wang, Xia Gao, Peng Gao, Weiwei Deng, Peng Yu, Jinjing
Ma, Jinhai Guo, Hualing Cheng, Chenying Zhang, Chuanfei
Yu, Xi Ma, Bingfeng Lv, Yang Lu, Taiping Shi, Dalong Ma：Cell-based
screening and validation of human novel genes associated
with cell viability. J Biomol Screen, 2006, 11(4):369-76.
2． Lan Wang, Chuanfei Yu, Yang Lu, Pengfei He, Jinhai Guo,
Chenying Zhang, Quansheng Song, Dalong Ma, Taiping Shi3,
Yingyu Chen. Apoptosis, accepted.
他引 SCI 论文：
1.Thorburn A ： Apoptosis and autophagy: regulatory connections between two supposedly different processes. APOPTOSIS 2008, 13(1):1-9
2. Cheng Y, Qiu F, Huang J, et al.Apoptosis-suppressing and autophagy-promoting effects of calpain on oridonin-induced L929 cell death. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2008,475(2): 148-155
Human Protein Atlas 公布的免疫组化表达谱：
Strong cytoplasmic and/or nuclear immunoreactivity was found in Leydig cells in testis, proximal tubuli in kidney, liver, adrenal gland and in respiratory epithelium. Most other tissues and cells were negative or weakly stained. Liver and renal carcinomas were cytoplasmic positive in a few cases. Most other malignancies were negative.
北京大学人类疾病基因研究中心
2008．04．28
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